Lambert-Beersches Gesetz (Photometrie)

Multipliziere den molaren Extinktionskoeffizienten ε, die Konzentration c und die Schichtdicke d: $A = \varepsilon{}\cdot{}c\cdot{}d$. Die Absorbanz A ist dimensionslos. Setze ε in $L\cdot{}mol^{-1}\cdot{}cm^{-1}$, c in $\frac{mol}{L}$ und d in cm ein, damit sich die Einheiten aufheben. Beispiel: Ein Protein mit $\varepsilon{} = 40 000 L\cdot{}mol^{-1}\cdot{}cm^{-1}$ in einer 1 cm Küvette bei $c =\frac{ 10^{-5} mol}{L}$ ergibt $A = 40 000\cdot{}10^{-5}\cdot{}1 = 0{,}40$. Aus der Absorbanz folgt die Transmission über $T = 10^{(-A)}$, hier also T = 10⁻⁰·⁴ ≈ 40 Prozent. Achte darauf, dass die Einheit von ε und die Schichtdicke zusammenpassen, meist beide in Zentimetern.

Stelle das Gesetz nach der Konzentration um: $c =\frac{ A}{(\varepsilon{}\cdot{}d)}$. Du misst die Absorbanz A der Probe im Photometer, kennst den molaren Extinktionskoeffizienten ε des Stoffes und die Schichtdicke d der Küvette. Aus diesen drei Größen ergibt sich die Konzentration. In der Praxis nimmt man oft eine Kalibriergerade auf, indem man die Absorbanz mehrerer bekannter Konzentrationen misst; ihre Steigung ist $\varepsilon{}\cdot{}d$. Aus der Absorbanz der unbekannten Probe liest man dann über die Gerade die Konzentration ab. Achte auf einheitliche Einheiten und darauf, im linearen Bereich zu bleiben. Diese Methode ist ein Standardverfahren der quantitativen Analytik, etwa zur Konzentrationsbestimmung von Farbstoffen oder Proteinen.

Bei hoher Absorbanz erreicht nur noch sehr wenig Licht den Detektor, weil fast alles absorbiert wird. Bei $A = 2$ kommt nur noch 1 Prozent des Lichts durch, bei $A = 3$ nur 0,1 Prozent. Dieses geringe Restsignal wird von Streulicht, Rauschen und Geräteungenauigkeiten dominiert, sodass kleine Messfehler große relative Fehler in der Konzentration verursachen. Außerdem verliert der lineare Zusammenhang bei hohen Konzentrationen seine Gültigkeit, weil sich Teilchen gegenseitig beeinflussen und das Gesetz nur für verdünnte Lösungen gilt. Deshalb misst man am genauesten im Absorbanzbereich zwischen etwa 0,1 und 1. Ist die Probe zu konzentriert, verdünnt man sie, statt eine unzuverlässige hohe Absorbanz zu messen.

Der molare Extinktionskoeffizient ε ist eine stoffspezifische Größe und gibt an, wie stark ein Stoff Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Er hat die Einheit $L\cdot{}mol^{-1}\cdot{}cm^{-1}$ und beschreibt die Absorbanz pro Konzentration und Schichtdicke. Ein großer Wert bedeutet, dass schon kleine Konzentrationen stark absorbieren, was empfindliche Messungen erlaubt. ε hängt von der Substanz, der Wellenlänge des Lichts und teils vom Lösungsmittel ab; deshalb misst man meist am Absorptionsmaximum, wo ε am größten ist. Farbstoffe und Proteine mit ausgedehnten Elektronensystemen haben oft sehr hohe Extinktionskoeffizienten. ε ist der Proportionalitätsfaktor, der Konzentration und gemessene Absorbanz im Lambert-Beerschen Gesetz verbindet.

Das Gesetz gilt nur unter mehreren Voraussetzungen: verdünnte Lösungen, monochromatisches Licht und keine Streuung oder chemischen Wechselwirkungen. Bei hohen Konzentrationen weicht die Absorbanz von der Linearität ab, weil sich die Teilchen gegenseitig beeinflussen und der Extinktionskoeffizient nicht mehr konstant ist. Ist das Licht nicht einfarbig, mischen sich verschiedene Wellenlängen mit unterschiedlichem ε und verfälschen das Ergebnis. Auch trübe oder streuende Proben, chemische Reaktionen, Assoziation oder Dissoziation der gelösten Teilchen führen zu Abweichungen. Ein häufiger Fehler ist, das Gesetz bei zu hohen Konzentrationen anzuwenden. Für klare, verdünnte Lösungen im Photometer liefert es dagegen sehr zuverlässige, lineare Zusammenhänge.